Penentuan Kadar Protein dengan Metode Lowry –Protein adalah senyawa organik kompleks berbobot molekul tinggi yang merupakan polimer dari monomer-monomer asam amino yang dihubungkan satu sama lain dengan ikatan peptida. Sebagai salah satu sumber gizi, protein berperan sebagai sumber asam amino bagi organisme yang tidak mampu membentuk asam amino tersebut (heterotrof) (Fessenden. 1986).
Protein adalah suatu zat dalam susunan kimianya mengandung unsure-unsur oksigen, karbon, hydrogen, nitrogen dan kadang-kadang mengandung unsure-unsur lain seperti sulfur dan fosfor (Girindra, A. 1986).
Protein merupakan suatu polipeptida dengan BM yang sangat bervariasi dari 5000 samapi lebih dari satu juta karena molekul protein yang besar, protein sangat mudah mengalami perubahan fisis dan aktivitas biologisnya. Banyak agensia yang menyebabkan perubahan sifat alamiah dari protein seperti panas, asam, basa, solven organik, garam, logam berat, radiasi sinar radioaktif (Sudarmadji, 1996).
Asam amino merupakan unit pembangun protein yang dihubungkan melalui ikatan peptida pada setiap ujungnya. Dari struktur umumnya, asam amino mempunyai dua gugus pada tiap molekulnya, yaitu gugus amino dan gugus karboksil, yang digambarkan sebagai struktur ion dipolar. Gugus amino dan gugus karboksil pada asam amino menunjukkan sifat-sifat spesifiknya. Karena asam amino mengandung kedua gugus tersebut, senyawa ini akan memberikan reaksi kimia yang yang mencirikan gugus-gugusnya. ( Hawab. 2004).
Metode Lowry mengkombinasikan pereaksi biuret dengan pereaksi lain (Folin-Ciocalteauphenol) yang bereaksi dengan residu tyrosine dan tryptophan dalam protein. Reaksi ini menghasilkan warna kebiruan yang bisa dibaca di antara 500 – 750 nm, tergantung sensitivitas yang dibutuhkan. Akan muncul puncak kecil di sekitar 500 nm yang dapat digunakan untuk menentukan protein dengan konsentrasi tinggi dan sebuah puncak besar disekitar 750 nm yang dapat digunakan untuk menentukan kadar protein dengan konsentrasi rendah. Metode ini lebih sensitif untuk protein konsentrasi rendah dibanding metode biuret. (Soeharsono, 2006).
Protein dengan asam fosfotungsat-fosfomolibdad pada suasana alkalis akan memberikan warna biru yang intensitasnya bergantung pada konsentrasi protein yang ditera. Untuk mengetahui banyaknya protein dalam larutan, terlebih dahulu dibuat kurva standar yang melukiskan hubungan antara konsentrasi dan optical dencity (OD).
Biasanya digunakan serum albumin. Larutan Lowry ada dua macam yaitu larutan A yang terdiri dari fosfotungstat-fosfomolibdad (1:1) dan larutan Lowry B yang terdiri dari Na-carbonat 2% dalam NaOH 0,1 N, kupri sulfat dan Na-K-tartat 2%. Cara penentuannya seperti berikut: 1 ml larutan protein ditambah 5 ml Lowry B, digojong dan dibiarkan selama 10 menit. Kemudian ditambah 0,5 ml Lowry A digojong dan dibiarkan 20 menit. Selanjutnya diamati OD-nya.
Metode Lowry merupakan pengembangan dari metode Biuret. Dalam metode ini terlibat 2 reaksi. Awalnya, kompleks Cu(II)-protein akan terbentuk sebagaimana metode biuret, yang dalam suasana alkalis Cu(II) akan tereduksi menjadi Cu(I). Ion Cu+ kemudian akan mereduksi reagen Folin-Ciocalteu, kompleks phosphomolibdat phosphotungstat (phosphomolybdotungstate), menghasilkan heteropoly molybdenum blue akibat reaksi oksidasi gugus aromatik (rantai samping asam amino) terkatalis Cu, yang memberikan warna biru intensif yang dapat dideteksi secara kolorimetri.
Salah satu alat yang dapat mengukur absorban dari larutan yang berwarna adalah spektrofotometer. Teknik spektrofotometri telah lama digunakan sebagai suatu teknik yang handal untuk deteksi, identifikasi, dan pengukuran kadar senyawa kimia dalam suatu larutan. Spektrum cahaya yang dapat terlihat oleh mata terentang antara 400 nm sampai 800 nm.
Pada teknik spektrofotometri, cahaya dari sumber cahaya diuraikan dengan menggunaka prisma sehingga diperoleh cahaya monokromatis yang diserap oleh zat yang akan diperiksa. Cahaya monokromatis merupakan cahaya satu warna dengan satu panjang gelombang, sehingga cahaya yang diserap oleh larutan berwarna dapat diukur. Hubungan antara konsentrasi dengan cahaya yang diserap dinyatakan dalam hukum Beer-Lambert. Hukum Beer-Lambert menyatakan pengurangan intensitas cahaya monokromatis yang melalui suatu larutan berwarna berlangsung secara eksponensial dan bergantung pada panjang larutan yang dilalui cahaya dan kadar zat dalam larutan
[wpspoiler name=”Buka Reference” ]Reference:
Fessenden. (1986). Kimia Organik Jilid 2. Jakarta : Erlangga.
Girindra, A. (1986). Biokimia I. Gramedia, Jakarta.
Hawab, HM. 2004. Pengantar Biokimia. Jakarta : Bayu Media Publishing.
Soeharsono. 2006. Biokimia 1. Yogyakarta: UGM Press
Soewoto, H., M., Sadikin, M., V., Kurniati, S., I., Wanandi, D., Retno, P., Abadi, A., Retnoprijati, I., P., Harahap, S., A., Jusman. (2001). Biokimia Eksperimen Laboratorium, Jakarta: Widya Medika
Sudarmaji, Slamet, dkk. (2007). Analisis bahan Makanan dan Pangan. Penerbit Liberty[/wpspoiler]