KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS -Kromatografi merupakan suatu metode yang digunakan untuk memisahkan campuran komponen berdasarkan distribusi komponen tersebut diantara dua fase, yaitu fase diam dan fase gerak (Stoenoiu et al. 2006). Apabila molekul-molekul komponen berinteraksi secara lemah dengan fasa diam maka komponen tersebut akan bergerak lebih cepat meninggalkan fasa diam. Keberhasilan pemisahan kromatografi bergantung pada daya interaksi komponen-komponen campuran dengan fasa diam dan fasa gerak (Hendayana, 2006).
Ada berbagai macam kromatografi yaitu gel filtrasi, kolom kromatografi, kromatografi partisi, kromatografi pertukaran ion dan gas kromatografi. Kromatografi partisi terdiri dari kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis (KLT).
KLT merupakan bentuk kromatografi planar yang serupa dengan kromatografi kertas, tetapi fase diamnya adalah serbuk halus, yang tersebar merata sebagai lapis tipis yang didukung plat plastis, alumunium atau plat gelas. Migrasi pelarut melewati fase diam dengan kecepatan yang ditentukan oleh rasio distribusi, dengan nilai pergerakkan yang besar (Kealey and Haines, 2002).
Sistem pengembangan yang digunakan pada KLT berdasarkan prinsip like dissolves like, yaitu memisahkan komponen bersifat polar menggunakan sistem pelarut yang bersifat polar juga ataupun sebaliknya. Deteksi hasil kromatogram dilakukan di bawah sinar UV pada panjang gelombang 254 nm dan 366 nm, serta dapat dilakukan juga dengan pereaksi semprot (Santosa dan Hertiani 2005). Pada KLT digunakan adsorben halus yang tersangga pada papan kaca, alumunium atau plastik.
Pelaksanaan kromatografi lapis tipis (Gandjar, 2007):
- Fase diam
Fase diam yang digunakan dalam KLT merupakan penjerap berukuran kecil dengan diameter partikel antara 10-30 μm. Semakin kecil ukuran ratarata partikel fase diam dan semakin sempit kisaran ukuran fase diam, maka semakin baik kinerja KLT dalam hal efisiensi dan resolusinya. Mekanisme sorpsi yang utama pada KLT adalah adsorpsi dan partisi.
- Fase Gerak
Fase gerak pada KLT dapat dipilih dari pustaka, tetapi lebih sering dengan mencoba-coba karena waktu yang diperlukan hanya sebentar. Sistem yang paling sederhana ialah campuran 2 pelarut organik karena daya elusi campuran kedua pelarut ini dapat mudah diatur sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat terjadi secara optimal. Berikut adalah beberapa petunjuk dalam memilih dan mengoptimasi fase gerak :
- Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena KLT merupakan teknik yang sensitif.
- Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga Rf terletak antara 0,2-0,8 untuk memaksimalkan pemisahan.
- Untuk pemisahan dengan menggunakan fase diam polar seperti silica gel, polaritas fase gerak akan menentukan kecepatan migrasi solute yang berarti juga menentukan nilai Rf. Penambahan pelarut yang bersifat sedikit polar seperti dietil eter ke dalam pelarut non polar seperti metil benzene akan meningkatkan harga Rf secara signifikan.
- Solut-solut ionik dan solute-solut polar lebih baik digunakan campuran pelarut sebagai fase geraknya, seperti campuran air dan methanol dengan perbandingan tertentu. Penambahan sedikit asam etanoat atau ammonia masing-masing akan meningkatkan solute-solut yang bersifat basa dan asam.
- Aplikasi (Penotolan) Sampel
Untuk memperoleh roprodusibilitas, volume sampel yang ditotolkan paling sedikit 0,5 μl. Jika volume sampel yang ditotolkan lebih besar dari 2-10 μl, maka penotolan harus dilakukan secara bertahap dengan dilakukan pengeringan antar totolan.
- Pengembangan
Bila sampel telah ditotolkan maka tahap selanjutnya adalah mengembangkan sampel dalam bejana kromatografi yang sebelumnya telah dijenuhi dengan uap fase gerak. Tepi bagian bawah lempeng tipis yang telah ditotoli sampel dicelupkan kedalam fase gerak kurang lebih 0,5-1 cm. Tinggi fase gerak dalam bejana harus dibawah lempeng yang telah berisi totolan sampel.
- Deteksi Bercak
Deteksi bercak pada KLT dapat dilakukan secara kimia dan fisika. Cara kimia yang biasa digunakan adalah dengan mereaksikan bercak dengan suatu pereaksi melalui cara penyemprotan sehingga bercak menjadi jelas. Cara fisika yang dapat digunakan untuk menampakkan bercak adalah dengan denagan cara pencacahan radioaktif dan fluorosensi sinar ultraviolet. Fluorosensi sinar ultraviolet terutama untuk senyawa yang dapat berfluorosensi, membuat bercak akan terlihat jelas.
- Perhitungan Nilai Rf
Untuk identifikasi dari senyawa-senyawa yang terpisah dari lapisan tipis menggunakan harga Rf (Racing factor). Rf (Racing factor) merupakan jarak pengembang senyawa pada kromatogra. Perhitungan nilai Rf didasarkan atas rumus :
[wpspoiler name=”Buka reference” ]Reference:
Gandjar, I. G., A. Rohman. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Pelajar. Yogyakarta.
Hendayana, S. 2006. Kimia Pemisahan: Metode Kromatografi dan Elektroforesis Modern. Cetakan I. PT Remaja Rosdakarya. Bandung.
Kealey, D. And Haines, P.. 2002. Instant Notes, Anal. Chem. Bios Scientific Publishers Limited, Oxford. USA. 131-135.
Santosa CM, dan Hertiani T. 2005. Kandungan senyawa kimia dan efek ekstrak daun bangun-bangun (Coleus ambonicus, L.) pada aktivitas fagositosis netrofil tikus putih (Rattus nervogicus). Majalah Farmasi Indonesia 16: 141-148.
Stoenoiu CE. Bolboaca AD, Jantschi L. 2006. Mobile phase optimization for steroid separation. edical Informatics 18: 17-24.[/wpspoiler]